Гипотермия – это состояние гомойотермного животного с пониженной температурой тела. В последние годы гипотермические состояния нашли широкое применение в медицинской практике при обширных операциях на сердце и мозге. Гипотермию применяют в целях зашиты различных органов и тканей от ишемических, реперфузионных и травматических повреждений [2]. Однако, на начальных этапах снижения температуры тела гипотермия сопровождается развитием ряда патологических процессов, связанных с нарушение кровоснабжения органов и развитием стрессор ной реакции. Все это в совокупности индуцирует развитие окислительного стресса, основой которого является интенсивная генерация активных форм кислорода АФК [7].

АФК могут способствовать окислительной модификации белков и липидов. Окисление липидов, составляющих основу мембран внутриклеточных органелл, может способствовать нарушению их барьерных и транспортных функций. Особо важная роль в развитии различных патологических процессов при экстремальных состояниях организма принадлежит митохондриям [5]. Это может быть обусловлено тем, что митохондрии играют ключевую роль в энергетическом обмене клетки, сигнальной трансдукции, регуляции кальциевого гомеостаза, в развитии окислительного стресса и апоптоза [10]. .Целью данной работы явилось исследование эффектов кратковременной (30 мин) умеренной (30ºС) гипотермии на проницаемость мембран митохондрий для ионов кальция, поскольку именно кальцию является регулятором многих процессов, протекающих в клетках.

Материалы и методы исследования

Опыты проведены на белых лабораторных крысах обоего пола весом 150-200 г. Охлаждение животных проводили в специальной камере, в рубашке которой циркулировала холодная вода (5ºС). При достижении ректальной температуры 30ºС животное декапитировали.

Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Все процедуры выполнялись на холоду при температуре 2-4 ˚С. Печень измельчали и готовили 10% гомогенат в среде выделения c БСА (бычий сывороточный альбумин), после чего центрифугировали при 2000 об/мин 10 минут. Гомогенат центрифугировали при 2000 об/мин 10 мин. Полученный супернатант центрифугировали при 10000 g 10 мин. Митохондрии суспендировали в 2 мл среды выделения, дополнительно содержащей БСА (2 мг/мл), затем добавляли 15 мл среды выделения без БСА и вновь центрифугировали 10 мин при 10000 g. Осадки митохондрий объединили в одну пробирку и центрифугировали при 10000 g 10 мин. Митохондрии суспендировали в небольшом объеме среды, не содержащей ЭДТА, и хранили на льду. Состав среды выделения: 0,2 М сахароза, 10 мМ Нереs, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ KCL; (рН=7.2)

Определение проницаемости митохондрий для ионов кальция производили спектрофотометрически, путем измерения их светопоглощения  (λ = 520 нм) в реакционной смеси, содержащей КСl (120мМ), КН2РО4 (3 мМ), Na-сукцинат (5 мМ) и трис-НСl (25мМ. рН-7,4) [8]. Реакцию начинали добавлением в инкубационную среду CaCl2 (420 µM). Скорость набухания митохондрий в результате входа кальция (ΔА540/мин на 1 мг белка) определяли, как изменение оптической плотности суспензии митохондрий в течение первой минуты инкубации с ионами кальция.

Достоверность различия средних определяли с помощью критерия Стьюдента. Каждая кривая на графиках есть среднее 6-ти независимых экспериментов. Различия считали достоверными при значениях р<0.05. Обработку данных вели на компьютере с использованием пакета СТАТИСТИКА.

Результаты исследования и их обсуждение

Исследована проницаемости митохондрий печени нормотермических и гипотермированных крыс для ионов Са2+. Известно, что повышение проводимости митохондриальных мембран для различных ионов вызывает проникновение в митохондрии молекул воды, что вызывает резкое повышение осмотического давления и набухание митохондрии. Кинетику набухания митохондрий можно оценить спектрофотометрически, по снижению оптической плотности инкубационной среды, содержащей митохондрии. На рис. 1 представлены кинетические кривые изменения оптической плотности митохондрий при добавлении ионов кальция (420 µM).

Из рисунка видно, что добавление ионов кальция в среду инкубации сопровождается снижением оптической плотности. При этом кинетические кривые имеют нелинейный характер, свидетельствующий о наличии двух фаз набухания митохондрий. Следует отметить, что набухание достигается до постоянного значения оптической плотности. В контроле постоянное значение оптической плотности достигается после 20 минутной инкубации митохондрий, в то время как при гипотермии - после 15 минут. Графики зависимости оптической плотности от времени инкубации митохондрий печени крыс, находящихся в различных физиологических состояниях значительно отличаются. Из рисунка видно, что зависимость у контрольных крыс более ярко выражена, нежели у гипотермированных.

.

Рис. 1. Са 2+ индуцированное открытие поры митохондрий печени крыс в норме и при умеренной кратковременной гипотермии. По оси ординат - оптичекая плотность на λ 540 нм (D). По оси абсцисс - время эксперимента (мин); ■ – контроль, ● - гипотермия

По изменению оптической плотности можно вычислить скорости набухания митохондрий (ΔD/мин). И таблицы 1 видно, что при гипотермии скорость набухания митохондрий при добавлении кальция уменьшается на 27,4% относительно контроля

Таблица 1 

Cкорость набухания митохондрий печени крыс в норме и гипотермии (М±m, n=6)

*-достоверные относительно контроля изменения

Полученные данные указывает на то, что, что митохондрии печени контрольных крыс имеют большую чувствительность к ионам Са2+, по сравнению с митохондрии печени гипотермированных животных. Из рисунка видно, что абсолютные значения оптической плотности митохондрий печени гипотермированных крыс ниже таковых контрольных. Это также может свидетельствовать о том, что при умеренной гипотермии in vivo уже произошли изменения проницаемости митохондрий, отражающиеся на степени их начального набухания. Все это, в совокупности, дает основание предполагать, что при гипотермии увеличивается проницаемость митохондрий для ионов, поэтому они, по сравнению с контролем, отличаются меньшей реактивностью к экзогенным добавкам кальция.

Изменение проницаемости митохондрий для кальция при гипотермии может быть связано с активацией неспецифических Са2+ - зависимых пор митохондрий. Пора образована комплексом белков и представляет собой канал, проходящий через наружную и внутреннюю мембраны митохондрии. Данный канал получил название «Мitochondrial рermeability transition pore, MPTP», что в переводе означает «пора, изменяющая проницаемость мембраны митохондрий» [6]. Оказалось, что между количеством митохондриальных пор и чувствительностью митохондрий к кальцию существует зависимость: чем больше открытых МРТР в митохондриях, тем меньше их чувствительность к кальцию.

МТРТ – это неспецифичный канал высокой проводимости, который состоит из различных макромолекулярных компонентов и образуется в местах соприкосновения наружной и внутренной митохондриальной мембраны. Универсальным активатором поры являются ионы кальция. Как известно из данных литературы, активация МРТР происходит за счет увеличения концентрации кальция с наружной стороны митохондрии, в частности в цитоплазме [8]. Кроме Са2+, активаторами поры могут являться жирные кислоты, ионы неорганического фосфора и т.д.. Активация поры также осуществляется при уменьшении мембранного потенциала митохондрии и повышении концентрации свободных радикалов [9].

Показано, что чувствительность MPTP к ионам кальция повышается при окислительном стрессе. В результате открытие поры возможно даже при физиологических концентрациях кальция в матриксе [3]. Итогом активации поры является повышение интенсивности образования АФК и выход в цитоплазму ферментов антиоксидантной системы митохондрий, что в значительной степени снижает процесс обезвреживания АФК. Было показано, что формирование поры стимулирует образование свободных радикалов митохондриальным комплексом І [8]. Это может играть важную роль в развитии патологических процессов.

Повышение проводимости МРТР индуцирует не только выход митохондриальных компонентов в цитоплазму, но и проникновение в митохондрии молекул воды, что вызывает резкое повышение осмотического давления, набухание митохондрии и их разрушение. Поэтому по степени набухания митохондрий и индукции его ионами кальция достаточно объективно можно судить об открытии МPTP

Полученные эффекты гипотермии на кальциевую проводимость митохондрий предположительно обусловлены повреждением митохондриальных мембран, вызванным повышением оксидативных процессов и понижением активности антиоксидантной системы клетки при гипотермии а также деэнергизацией органелл при разобщении [11]. В работе Эмирбекова Э. З. и Кличханова Н. К. [7] было показано, что при гипотермии в различных тканях животных происходит интенсификация свободно-радикальных процессов, сопровождающаяся истощением компонентов антиоксидантной системы.

Известно, что на начальных этапах развития, гипотермия сопровождается стрессорной реакцией, при которой происходит активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы [4]. В результате включаются механизмы химической терморегуляции, направленные на увеличение теплопродукции: усиливается обмен веществ, увеличивается распад гликогена и липидов [1]. Усиление липолиза в тканях способствует увеличению в них концентрации свободных жирных кислот, которые являются разобщителями окислительного фосфорилирования. Результатом такого разобщения может стать снижение степени сопряжения окисления и фосфорилирования в митохондриях, с последующей их деэнергизацией и снижением кальциевой ёмкости